Notiuni si principii de baza ale biotehnologiei vegetale

Materialul utilizat in culturile in vitro este reprezentat de portiuni, fragmente de planta intreaga, de strucuri complexe (organe, fragmente de organe), tesuturi, sau celule vegetale

Plantele sunt

Organisme eucariote (eu = adevarat, carion = nucleu)

Capabile de fotosinteza = convertesc energia luminoasa in energie chimica

Autotrofe = sintetizeaza compusi organici complecsi pornind de la

compusi anorganici simpli - apa, CO₂ si saruri minerale

Sunt organisme multicelulare complexe, alcatuite din diferite tipuri de

celule si tesuturi

Se pot reproduce sexuat si/sau asexuat (vegetativ)

Sunt organisme care nu se deplaseaza, ca urmare depind de un anumit mediu de viata si sunt foarte sensibile la variatiile factorilor de mediu. Orice modificare a acestor factori determina modificarea programelor de dezvoltare si de diferentiere celulara. Celulele vegetale au un program de diferentiere foarte flexibil, fiind apte, in anumite conditii sa regenereze organisme complete, aptitudine cunoscuta sub numele de 'totipotenta celulara'.

Totipotenta celulei vegetale - proprietatea unei celule de a genera orice alt tip de celula, pana la organism intreg. 

In cultura in vitro procesul de dezvoltare porneste de la un grup de celule, care in conditii adecvate de nutritie (asigurate de compozitia mediului de cultura) si ambient (temperatura, umiditate, lumina - asigurate tehnic in camera de crestere) asigura diferentierea de noi structuri, pana la obtinerea unei plante intregi.

Cresterea, dezvoltarea si reproducerea plantelor superioare

Etapele diferentierii, cresterii si dezvoltarii plantelor

A. De la celula initiala la plantula

Corpul unei plante, format din milioane de celule specializate structural si functional, ia nastere dintr-o singura celula ca urmare a reproducerii vegetative, sau sexuate.

a)     La plantele cu capacitate de reproducere vegetativa, celula initiala este in meristemele din organele preexistente. Aceste celule meristematice parcurg mitoze repetate (diviziuni egale si repetate ale celulelor, fara modificarea cantitatii de ADN)), rezultand noi celule, tesuturi si ulterior o noua planta.

Meristemele sunt localizate

la varfurile de crestere ale lastarilor si radacinilor (meristeme apicale)

in cambiul tulpinii si scoartei (meristeme laterale)

in frunze si fructe.

Celule meristematice initiale (activate) diviziuni mitotice

organe noi plantula noua

Ex: formarea de novo a radacinilor si/sau a lastarilor din butasi de tulpina, radacina, frunza.

In cazul reproducerii vegetative

diferentierea de noi tesuturi si regenerarea de noi plante porneste de la un singur parinte (planta donatoare de organ)

noul organism (planta noua regenerata) este rezultatul diviziunilor mitotice

iar noile plante (descendenta) rezultate sunt identice atat intre ele, cat si cu planta de origine.

b) La plantele cu reproducere sexuata, celula initiala numita ou, sau zigot este rezultatul unirii gametilor in procesul fecundarii. Aceasta celula parcurge mai multe diviziuni (prima asimetrica, urmata de mai multe diviziuni simetrice) rezultand formarea embrionului prin procesul numit embriogeneza zigotica.

Embrionul parcurge mai multe etape de dezvoltare:

globular - o sfera multicelulara in care incep procesele de histogeneza

inima - diviziunile celulare se directioneaza si incep sa fie vizibile cele doua cotiledoane

torpedo - se alungesc cotiledoanele si axul principal

cotiledonar - cotiledoanele sunt complet dezvoltate, iar la cele doua extremitati se gasesc meristemul apical al tulpinii si cel apical al radacinii

maturare - se sintetizeaza proteinele de rezerva

deshidratarea si latenta, proces care are loc simultan cu transformarea ovulului in samanta)

[Caracteristic pentru plante este faptul ca in conditii de cultura in vitro se pot forma embrioni si din celule somatice, care nu sunt produsul fuziunii gametilor de sex opus. Procesul se numeste embriogeneza somatica si implica parcurgerea acelorasi stadii de dezvoltare (globular, inima, torpedo, cotiledonar, alungire si maturare). Procesul embriogenezei somatice poate fi indus in conditii experimentale de cultura in anumite tipuri de celule si prezinta anumite particularitati biochimice, fiziologice si genetice.

Referat: Anatomia aparatului locomotor - sistemul osos, rolul oaselor in organism Referat: Reflexe mucoase

Pentru ca meristemele apicale sa se activeze si embrionul sa-si reia cresterea, samanta trebuie sa germineze. Germinarea are loc in anumite conditii de temperatura si umiditate, pe seama rezervelor de hrana din endosperm si cotiledoane.

Celula ou (rezultat al meiozei si fecundarii) embrion stadii globular- inima - torpedo - cotiledonar - maturare - latenta germinarea semintei plantula

In cazul reproducerii  sexuate

la originea noi plante sunt doi parinti, fiecare cu zestrea sa genetica (gameti haploizi de la ♀ si de la ♂ rezultati ca urmare a diviziunii meiotice)

noul organism este rezultatul diviziunilor mitotice din embrion

noile plante (descendenta) rezultate manifesta variabilitate datorita recombinarii genetice din timpul formarii gametilor si al fecundari. Fiecare individ reprezinta rezultatul combinarii intamplatoare a gametilor in procesul de fecundare.

B. De la plantula la planta matura

Corpul unei plate este alcatuit in principal din trei organe: radacina, tulpina si frunza. Aceste structuri complexe se formeaza prin activarea meristemelor care, la randul lor, se formeaza in cursul proceselor de diferentiere. Celulele meristematice isi pastreaza capacitatea de a se divide prin mitoza pe tot parcursul perioadei de dezvoltare a plantei. Celulele meristematice au urmatoarele caracteristici:

nucleul mare, dispus central, cu nucleol voluminos

valoare mare a raportului nucleu/citoplasma

vacuom redus

mitocondrii numeroase

plastide nediferentiate

Pe masura ce planta creste si se dezvolta, celulele meristematice se specializeaza, formand tesuturi, care alcatuiesc organe: radacina, tulpina, frunza, flori si fructe.

Un tesut este alcatuit din unul, sau mai multe tipuri de celule specializate. Diferentierea celulara presupune o serie de modificari structurale corelate cu indeplinirea unor functii specifice. Aceste modificari constau in:

cresterea volumului celulelor

reducerea raportului nucleu/citoplasma

dezvoltarea vacuomului

diferentierea plastidelor

diferentierea peretelui celular.

Culturile in vitro la plante  se caracterizeaza prin faptul ca:

celulele meristematice isi continua, sau isi reiau activitatea mitotica (se asigura diferentierea celulara)

celulele diferentiate, (care in planta, in conditii normale, nu se divid), stimulate prin ranire (in timpul manipularii), sau de hormonii adaugati la mediul de cultura, se dediferentieaza si dobandesc capacitatea de a se divide (se asigura cresterea in volum a structurilor).

Aceasta capacitate de dediferentiere este specifica plantelor. Ulterior, unele celule dediferentiate se pot  rediferentia, devenind celule specializate. Specializarea lor poate fi insa diferita de cea a celulelor din care provin.

Mediile de cultura, rolul si importanta diferitilor constituenti

Explantul vegetal cultivat in vitro, respectiv inoculul vegetal, constituie un fragment vegetal, care odata detasat de pe planta devine o entitate independenta de locul de origine. Explantul detine informatia genetica a plantei donor, precum si toate functiile sale de la locul de origine de unde a fost desprins.

Explantele vegetale detasate prin sectionare de pe fragmentul sau organul  vegetal, sunt sterilizate conform unui protocol adecvat, iar apoi sunt inoculate pe medii de cultura complexe.

Explantul vegetal, odata extras din sistemul complex de multiple interconexiuni si interdependente structurale si functionale ale organismul viu, trebuie sa-si reia functiile vitale intr-un cadru artificial asigurat de conditiile de cultura. Compozitia mediului de cultura trebuie sa asigure viabilitatea explantelor si continuarea dezvoltarii lor in mod dirijat prin reglarea conditiilor de mediu ambiental (lumina, intensitatea luminii, fotoperioada, temperatura, aerarea substratului).

In functie de natura tesutului, de momentul in care acesta a fost recoltat si inoculat, precum si de specie, se recomanda alegerea unui anumit mediu de cultura. Diferiti cercetatori au studiat cerintele nutritive ale plantelor si in baza rezultatelor obtinute au stabilit retete ale compozitiei mediilor pentru cultura in vitro, medii care sunt cunoscute dupa numele autorului lor. De ex: White, Gautheret, Gamborg, Murashige si Skoog, Eriksson, Nitsch, Liensmayer, etc.

Stabilirea componentelor mediului de cultura, respectiv a elementelor chimice indispensabile viabilitatii si continuarii dezvoltarii explantelor s-a facut fie pe baza cercetarilor de nutritie a plantelor (componenta cenusei, a sevei brute si elaborate, absorbtia selectiva a ionilor, determinari cantitative si calitative ale principalelor grupe de compusi chimici), fie pe baza determinarilor biochimice, biometrice, citologice si morfologice ale explantelor pe diferite variante de mediu de cultura.

Un mediu de cultura contine:

A.    Compusi anorganici

B.    Compusi organici

C.    Agent gelifiant in cazul mediilor solide

A.     Componenta anorganica a mediilor de cultura

- Substantele anorganice folosite pentru compozitia mediilor de cultura sunt reprezentate de: apa, fosfati, azotati, cloruri si sulfati de Ca, K, Mg, Mn, Al, Fe, Cu, Ni, Mo, Na.

Apa cel mai important component al materiei vii. Pierderea apei din tesutul vegetal prin scaderea umiditatii aerului, sau prin cresterea concentratiei componentelor mediului de cultura, determina scaderea turgescentei structurilor vegetale, concomitent cu pierderea apei prin evaporare. Ca urmare:

fragmentarea materialului vegetal in vederea detasarii explantului pentru inoculare trebuie sa se faca rapid, astfel ca sa se evite deshidratarea tesuturilor;

inocularea explantelor pe medii hipertonice (concentratie crescuta a componentelor mediului) determina pierderea apei din tesuturi prin exosmoza, urmata de plasmoliza celulelor.

Daca aceste situatii (de mentinere timp indelungat a explantelor pe suprafata de lucru, inainte de inoculare, sau de mentinere a explantelor pe acelasi mediu, fara transfer pe un nou mediu cu concentratie reechilibrata) se mentine pe durata lunga, va determina moartea celulelor si respectiv a explantelor (necrozare).

Compusii anorganici

Sunt introdusi in mediul de cultura sub forma de saruri. Cele mai uzuale saruri minerale folosite la prepararea mediilor de cultura sunt: fosfatii, azotatii, clorurile si sulfatii de : Ca, K, Mg, Mn, Al, Fe, Mo, Zn, Cu, Na, etc. (compusii anorganici sunt alcatuiti din elemente chimice)

In functie de participarea lor la constituirea structurilor biologice, elementele chimice au fost arbitrar impartite in

macroelemente - C, O, H, N, K, Ca, P, S, Mg si care sunt necesare in cantitati de milimoli (mM)

microelemente - Fe, Mn, Zn, Al, Cu, Mo, Na, Co, I si care se administreaza in concentratii de micromoli (μM)

Rolul fiziologic al fiecarui element chimic variaza in functie de forma chimica in care este prezent in mediu, de concentratia lui, de tipul de explant. Fenomenele manifestate ca urmare a cantitatilor insuficiente, sau prea mari ale elementelor chimice se pot evidentia dupa doua, sau mai multe subculturi pe acelasi tip de mediu (cu aceesi compozitie chimica) Ex:

Omiterea din mediu de cultura a compusilor anorganici cu N, S sau P determina moartea explantelor in scurt timp

Omiterea, sau carenta de N determina acumularea de antocieni in vacuolele celulelor inoculului

Lipsa de S, sau carenta de Fe determina cloroza tesuturilor

Excesul de S si P determina aparitia necrozelor

Excesul de Na si K determina vitrifierea explantelor si incetinirea cresterii

Natura compusilor chimici anorganici, proportia si concentratia lor influenteaza considerabil cresterea si morfogeneza la nivelul tesuturilor. De ex:

La tutun - absenta Fe si insuficienta anionului fosforic, aportul insuficient de KNO₃ , de Ca(NO₃), Na₃PO₃, NaCl si BoCl, determina oprirea proceselor de crestere

Meristemele necesita prezenta in medii a unor cantitati mari de compusi cu K

Tesuturile mature, sau in faza de senescenta necesita medii imbogatite cu Ca.

In alegerea mediilor adecvate pentru cultura se tine cont de faptul ca absobtia ionilor din mediu se face selectiv, ceea ce schimba raporturile ionice, pH-ul si chiar solubilitatea sarurilor, determinand inaccesibilitatea sau precipitarea unor substante.

B  Componenta organica a mediilor de cultura Celulele si tesuturile vegetale cultivate in vitro nu sunt autotrofe, adica nu sunt capabile sa sintetizeze carbohidrati prin asimilarea CO₂ in timpul fotosintezei. Atat timp cat se afla in conditii artificiale de cultura, structurile vegetale in vitro sunt heterotrofe, sau mixotrofe si drept urmare sunt dependente de componentele nutritive ale mediului de cultura.

Carbonul organic este prezent in compozitia mediilor de cultura sub forma compusilor glucidici. Prin degradarea glucidelor, celulele vegetale obtin energia necesara functionarii, a desfasurarii proceselor vitale, respectiv realizarea cresterii si multiplicarii.

La plante, glucidele intra in constitutia componentelor structurale ale membranelor (celuloza), in constitutia rezervelor nutritive (amidonul), in alcatuirea unor enzime si a acizilor nucleici.

Dintre glucide, s-au dovedit a fi indispensabile pentru cultura in vitro zaharoza si glucoza, iar cantitatile optime ale acestora variaza intre 2 si 5%, in functie de tipul de explant. Pentru anumite tipuri de explante se pot utiliza fructoza, maltoza, rafinoza.

Vitaminele in conditiile culturii explantelor pe medii aseptice sunt indispensabile pentru cresterea si diferentierea structurilor. La mediile de cultura se adauga in mod curent, cantitati de 0,1 pana la 10 mg/l din urmatoarele vitamine: Tiamina (B1), Riboflavina (B2), piridoxina (B6), acidul nicotinic (PP), acidul folic (M), acidul ascorbic ( C ).

Regulatorii de crestere, sau fitohormonii sunt compusi organici care in concentratii foarte mici produc stimulari, inhibari sau modificari calitative ale cresterii si dezvoltarii plantelor. La plantele superioare exista 5 clase de asemenea substante:

auxine, citochinine si gibereline care stimuleaza in mod diferit metabolismul celular

acidul abscisic care actioneaza ca un inhibitor al metabolismului celular, fiind utilizat pentru inducerea intrarii in repaus a embrionilor (zigotici sau somatici), sau pentru conservarea in vitro a materialului vegetal pe durate lungi si medii.

etilena, care are dubla actiune - stimulatoare si inhibitoare a metabolismului celular.

Toate substantele reglatoare ale cresterii (naturale, sau de sinteza) au urmatoarele caracteristici:

Sunt molecule mici care trec usor prin peretii celulelor

In doze mici au efect benefic, specific, dar in doze mari sunt toxici

Sunt sintetizati in anumite tesuturi, de unde sunt transportati la celulele tinta unde se observa actiunea lor (auxinele sunt sintetizate in varful lastarilor, de unde sunt transportate spre baza plantei - radacini -  cu o viteza de 1 cm/h)

In functie de celula tinta, actiunea lor specifica se manifesta la concentratii mici de 10^-4 - 10^-5

Intervin in numeroase procese fiziologice si actioneaza simultan. Ex: la nivelul tulpinii - auxina + giberelina stimuleaza alungirea celulelor, implicit a tijei florale; auxina + citochinina regleaza cresterea mugurilor laterali.

Pentru culturile de celule si tesuturi vegetale, in compozitia mediilor se folosesc auxinele, citochininele si mai rar giberelinele.

Auxinele  sunt utilizate in culturile vegetale in concentratii cuprinse intre 0,01 si 10 mg/l. Adaugate in concentratii adecvate, auxinele determina:

Elongarea celulelor

Cresterea tesuturilor si marirea plasticitatii peretilor celulari

Stimuleaza diviziunea celulara

Formarea de radacini adventive (rizogeneza)

Inhibarea formarii de lastari adventivi si axilari

Initierea formarii calusului

Inducerea embriogenezei

Auxinele utilizate adesea la prepararea mediilor de cultura sunt: acidul indolilacetic AIA - auxina naturala, acidul indolilbutiric AIB, acidul indolilpropionic AIP, acidul alfa naftilacetic ANA, acidul 2,4 diclorofenoxiacetic 2,4-D, acidul picolinic, picloram.

Citochininele  sunt utilizate in culturile vegetale in concentratii cuprinse intre 0,1 si 10 mg/l. Adaugate in concentratii adecvate, auxinele determina:

reglarea diviziunilor celulare, de aceea sunt utilizate in combinatii cu auxinele  pentru initierea si mentinerea culturilor de calus

stimuleaza formarea mugurilor (organogeneza) in calusuri si diferite tipuri de explante

stimuleaza formarea lastarilor axilari si adventivi multipli

inhiba formarea radacinilor

stimuleaza activitatea proteinelor si enzimelor

organogeneza directa

organogeneza indirecta

calusogeneza

embriogeneza

rizogeneza

auxina citochinina

Cel mai mult sunt utilizate citochininele: 6 benzil aminopurina BAP, kinetina, adenina si zeatina.

Giberelinele - reprezentate prin acidul giberelic GA₃, giberelina GA4 si giberelina GA7 au rol in alungirea internodiilor si disparitia simptomelor de nanism, determina iesirea din latenta a semintelor si mugurilor dorminzi, exercita o actiune complexa in anteza, au rol in formarea fructelor, stimuleaza germinarea embrionilor somatici in vitro.

C. Agent gelifiant in cazul mediilor solide este reprezentat de un polizaharid extras din algele genului Gelidium. Compusul cu actiune gelifianta se dizolva usor in apa la 90s^C si prin racire formeaza un gel transparent. Consistenta mediului de cultura depinde de natura gelului si de concentratia sa. Exemple de compusi utilizati pentru gelifiere: agar, agaroza, agargel, fitagel, gelrite.