Desemnarea de primeri specifici pentru amplificarea secventelor ARN de interes filogenetic

Desemnarea de primeri specifici pentru amplificarea secventelor ARN de interes filogenetic

Fragmentul ADN care urmeza sa fie amplificat este desemnat prin selectarea primerilor. Primerii reprezinta oligocatene scurte, artificiale de ADN, nu mai lungi de 50 pb (de obicei de 18-25 nucleotide), care marcheaza inceputul si sfarsitul fragmentului ADN de amplificat. Primerii aneleaza (adera) la catena ADN la aceste puncte de inceput si de sfarsit, unde ADN Polimeraza se leaga si incepe sinteza unei noi catene ADN.

Alegerea lungimii si temperaturii de melting a primerilor (Tm) depinde de un numar de factori. Temperatura de melting a primerilor este definita ca tempertura sub care primerul va anela la catena ADN si deasupra careia primerul va disocia de catena ADN. Temperatura de melting creste cu lungimea primerului. Primerii care sunt prea scurti vor anela in cateva pozitii de-a lungul catenei de ADN ceea ce va determina generarea de copii nespecifice. Pe de alta parte, lungimea unui primer este limitata de temperatura de melting. O temperatura de melting prea mare, de exemplu, de aproximativ 80sC, poate cauza probleme deoarece ADN Polimeraza este mai putin activa la astfel de temperaturi. Lungimea optima a unui primer este de obicei de 18-25 nucleotide, cu o temperatura optima intre 50 sC si 75 sC.

Uneori sunt folositi primeri degenerati. Acestia reprezinta de fapt un amestec de primeri similari, dar nu identici. Acest tip de primeri este potrivit daca se doreste amplificarea aceleiasi gene de la organisme diferite, deorece aceste gene sunt similare, dar nu identice. Folosirea primerilor degenerati poate reduce specificiatatea amplificarii PCR. Problema poate partial rezolvata prin folosirea tehnicii touchdown PCR.

Din cauza considerentelor mentionate, desemnarea primerilor reprezinta un process precis, de care depinde cantitatea de produs obtinut:

. Continutul de GC nu trebuie sa fie intre 40-60%.

Temperatura de melting calculata pentru ambii primeri utilizati in reactie nu trebuie sa difere cu maxim 5sC si temperatura de melting a produsului de amplificare nu trebuie sa difere de cea a primerilor cu maxim 10 sC.

. Temperatura de anelare este de obicei cu 5 sC mai mica fata de Tm calculata.

. Trebuie evitata formarea dimerilor de primeri.

. Capatul 3' este foarte sensibil si nu trebuie sa fie complementar cu orice alta regiune a altui primer folosit in recatie.

La ora actuala exista programe care sunt de un real folos in desemnarea primerilor.

Desemnarea primerilor specifici pentru amplificarea secventelor genice ARN_r16S, ARN_r12S si ARN_t  la speciile de salmonide analizate s-a realizat cu ajutorul programului Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/), urmarind urmatoarele etape:

1.secventa de interes a fost descarcata din baza de date NCBI (National Center for Biotechnology Information) si salvata in format fasta.

2.secventa a fost introdusa in programul Primer3 si se pastreaza setarile recomandate. Se selecteaza <Pick left primer> pentru desemnarea primerului sens, respectiv <Pick right primer> pentru primerul antisens. Pentru alegerea primerilor se selecteaza comanda <Pick Primers>.

3.Secventele primerului sens, respectiv antisens generate de programul Primer3 vor fi prezentate intr-o fereastra noua.

In noul format generat de Primer3 dupa selectarea comenzii <Pick Primers> se regasesc urmatoarele informatii: secventa primerilor sens si antisens, situsul de legare a primerilor, temperatura de melting si procentul GC al primerilor, lungimea produslui PCR amplificat cu primerii respectivi (Figura 1).

Figura 1. Secventele primerilor generate de programul Primer3.

4.Secventele primerilor vor fi  introduse pentru verificarea identitatii intr-un program din baza de date GenBank: BLAST. BLAST parcurge secventele din banca de date, oprindu-se la fiecare litera din secventa bancii, care are corespondenta cu secventa data. BLAST incearca sa realizeze un aliniament local, fara sa insereze spatii in aceste secvente. Rezultatul obtinut prin analiza BLAST este redat in cateva secunde sub forma unui tabel in care sunt afisate toate procentajele de identitati obtinute. In cazul in care secventa cautata se regaseste in baza de date, rezultatul afisat de catre aplicatia BLAST il reprezinta genele cu identitatile de secventa afisate in ordine descrescatoare