Diferențele dintre specii in urma secvențieri și comparari cu baza de date GenBank

Diferențele dintre specii in urma secvențieri și comparari cu baza de date GenBank

Fragmentele obtinute pentru ARNr 16S la speciile de salmonide din Romania au fost secventiate si comparate cu secvente similare din baza de date GenBank. Initial, secventele au fost analizate si corectate manual cu ajutorul programului BioEdit. Alinierea secventelor a fost realizata cu programul ClustalX.

Pentru reprezentantii speciei Salmo trutta fario (pastrav indigen), provenind din diferite bazine hidrografice, secventele obtinute pentru ARNr 16S au fost aliniate cu o secventa similara din GenBank (NC_01007). Secventa genei pentru ARNr 16S din baza de date GenBank aleasa pentru alinierea si compararea cu secventele obtinute de noi la pastravul indigen, provine de la specia Salmo trutta trutta (pastrav de mare). A fost aleasa aceasta secventa, deoarece pentru Salmo trutta fario nu exista in bazele de date secventa integrala a genelor mitocondriale pentru ARNr 16S, ARNr 12S si ARNt^Pro/Thr.

Comparativ cu secventa genei pentru ARNr 16S (NC_010007), in cazul reprezentantilor de pastrav indigen din Romania au fost identificate urmatoarele polimorfisme: 301 A>G, 360 C>T, 454 T>C, 479 A>G, 587 A>G, 655 G>A (Figura 7). Numerele indica pozitia din gena ARNr 16S din GenBank la nivelul careia se inregistreaza polimorfismele mentionate. Acestea sunt mutatii silentioase, cu frecventa aleatoare si care se pare ca nu afecteaza functia ARNr 16S, ci au rol evolutiv.

In ceea ce priveste secventele pentru ARNr 16S provenind de la indivizi de pastrav indigen din Romania, a fost identificat un singur poilmorfism intraspecific 265 G>A in cazul probei de pastrav indigen din raul Cerna. Confirmarea acestui polimorfism la un numar mai mare de indivizi ar putea constitui un marker pentru diferentierea populatiilor de pastrav indigen din raul Cerna de celelalte populatii de pastrav indigen din fauna tarii noastre.

Astfel, in cazul indivizilor analizati s-au identificat doua haplotipuri mitocondriale in cazul genei pentru ARNr 16S - S. t. fario 16S H1 (pastrav indigen raul Dambovita/ pastrav indigen raul Nera) si S. t. fario 16S H2 (pastrav indigen raul Cerna).

Secventele obtinute pentru ARNr 16S de la Salmo trutta labrax au fost aliniate cu secventa similara din GenBank pentru Salmo trutta truta (NC_010007). Comparativ cu secventa genei pentru ARNr 16S (NC_01007), in cazul indivizilor de pastrav de Marea Neagra (Salmo trutta labarx) au fost identificate urmatoarele polimorfisme: 614 A>G, 728 A>G. Aceste polimorfisme se inregistreaza in pozitii nucleotidice distincte ale genei mitocondriale pentru ARNr 16S, comparativ cu polimorfismele inregistrate la Salmo trutta fario.

In cazul secventei obtinute la Salmo trutta labrax, se observa o variatie nucleotidica mai redusa comparativ cu secventele de la Salmo trutta fario, raportate la secventa omoloaga din GenBank pentru Salmo trutta trutta. Se pare ca intre pastravul de Marea Neagra (Salmo trutta labrax) si pastravul de mare (Salmo trutta trutta) din nord-vestul Europei (coastele atlantice) si Marea Baltica, exista o inrudire stransa. Aceasta inrudire este demonstrata atat de similaritatea mare a secventelor nucleotidice analizate de noi, dar si de comportamentul asemanator al celor doua specii. Atat Salmo trutta labarx, cat si Salmo trutta trutta, sunt specii care isi desfasora ciclul de hranire si crestere in mare, de unde intreprind o migratie de reproducere in rauri.

In cazul speciei Oncorhynchus mykiss, probele biologice au provenit din diferite pastravarii din Romania. Dintre toate speciile de salmonide din tara noastra, pastravul curcubeu se preteaza cel mai bine la cresterea intensiva. In Romania aceasta, specie se creste exclusiv in pastravarii pentru consum alimentar.

In cazul probelor de pastrav curcubeu analizate de noi, secventele nucleotidice obtinute pentru ARNr 16S au fost aliniate cu secventa similara din GenBank (L29771) cu ajutorul programului Clustal X.

Comparativ cu secventa genei pentru ARNr 16S (L29771), in cazul pastravilor curcubeu din Romania au fost identificate mai multe tipuri de mutatii punctiforme, de tipul tranzitii (inlocuirea unei purine/pirimidine cu o alta purina/pirimidina), transversii (inlocuirea unei purine cu o pirimidina sau invers), insertii (Tabel 1).

Tabel 1: Polimorfisme identificate in secventa nucleotidica a genei pentru ARNr 16S la specia Oncorhynchus mykiss.

Au fost identificate in total trei haplotipuri mitocondriale la probele de pastrav curcubeu analizate. Probele O_mykiss_ Damb si O_mykiss_Gilau prezinta acelasi haplotip, in timp ce probele O_mykiss_I10 si O_mykiss_KH prezinta haplotipuri mitocondriale distincte pentru secventa genica ARNr 16S analizata.

Existenta polimorfismelor intraspecifice si a mai multor haplotipuri mitocondriale ale secventei genei pentru ARNr 16S la O. mykiss poate fi explicata de faptul ca, in decursul anilor, aceasta specie a fost incrucisata selectiv la nivel mondial prin reproducere artificiala, rezultand un numar destul de mare de varietati de O. mykiss, care au fost introduse si in pastravariile din Romania.

In cazul probelor de lipan analizate de noi, secventa obtinuta pentru un fragment din gena pentru ARNr 16S a fost aliniata cu o secventa similara din GenBank (FJ853655) cu ajutorul programului ClustalX .

Exemplarele de lipan luate in studiu provin din raul Cerna. Comparativ cu secventa genei pentru ARNr 16S din baza de date a NCBI, in cazul secventei de Thymallus thymallus analizate de noi au fost identificate urmatoarele polimorfisme: G>A, C>T, aflate in pozitia 166, respectiv 673 a genei mitocondriale pentru ARNr 16S. Acestea sunt mutatii silentioase, cu frecventa aleatoare si care, se pare ca nu afecteaza functia ARNr 16S. Numarul relativ scazut de variatii nucleotidice, indica un grad de conservare ridicat a secventei genei ARNr 16S la Thymallus thymallus.

La Salvelinus fontinalis, secventele obtinute pentru un fragment din gena mitocondriala care codifica pentru ARNr 16S au fost aliniate si comparate cu secventa similara din GenBank (NC_000860).

Aliniamentul realizat cu programul ClustalX, arata ca intre secventele nucleotidice provenid de la indivizii de pastrav fantinel din Romania si secventa omoloaga din GenBank nu exista variatii.

Probele de pastrav fantanel analizate provin din bazine hidrografice distincte: raul Bratia (bazin Arges), raul Gilau (bazin Lotru) si ferma RNP Bradisor (jud. Valcea). Se pare, astfel, ca gena mitocondriala pentru ARNr 16S nu poate fi utilizata ca marker molecular pentru diferentierea populatiilor de Salvelinus fontinalis, geografic distincte si izolate reproductiv.

Secventele obtinute pentru ARNr 12S la reprezentanti ai speciei Salmo trutta fario (pastrav indigen), din diferite bazine hidrografice au fost aliniate si comparate cu o secventa similara din GenBank (NC_01007). Secventa cu numarul de acces NC_10007 provine de la specia Salmo trutta trutta (pastrav de mare), specie care se gaseste in nord vestul Europei.

Comparativ cu secventa pentru ARNr 12S din GenBank, in cazul secventelor obtinute pentru un fragment din aceasta gena mitocondriala la pastravul indigen au fost identificate trei polimorfisme: 27 C>T, 28 A>C, 387 T>C. Polimorfismele identificate reprezinta mutatii punctiforme (tranzitii) cu rol evolutiv.

Numarul de variatii nucleotidice in cazul genei ARNr 12S de la Salmo trutta fario este mai redus comparativ cu cel pentru gena ARNr 16S analizata anterior la aceeasi specie, indicand ca aceasta gena este mai bine conservata intre reprezenantii genului Salmo.

Secventele obtinute pentru ARNr 12S de la Salmo trutta labrax au fost aliniate cu secventa similara din GenBank pentru Salmo trutta truta (NC_010007) si a fost identificat un polimorfism in G>A in pozitia. Numarul polimorfismelor identificate la nivelul fragmentului genei ARNr 12S analizat la Salmo trutta labrax este mai redus decat la Salmo trutta fario, raportandu-ne la secventa omoloaga din baza de date pentru Salmo trutta trutta.

Datele obtinute pentru cele doua specii de salmonide din Romania, pastravul indigen si pastravul de Marea Neagra, in ceea ce priveste variatia secventei nucleotidice pentru gena ARNr 12S, sunt in concordanta cu datele prezentate anterior pentru gena ARNr 16S, si confirma inrudirea mai stransa intre pastravul de Marea Neagra (Salmo trutta labarx) si pastravul de mare (Salmo trutta trutta) din nord-vestul Europei.

Secventele obtinute pentru un fragment din gena ARNr 12S, au fost corectate si analizate cu programul BioEdit si au fost aliniate secventa similara din GenBank (DQ288268). Comparativ cu secventa genei pentru ARNr 12S (DQ288268), in cazul reprezentantilor de pastrav curcubeu din Romania au fost identificate urmatoarele variatii ale secventei nucleotidice (Tabel 2).

Tabel 2: Polimorfisme identificate in secventa nucleotidica a genei pentru ARNr 12S la specia Oncorhynchus mykiss.

Similar cu secventele analizate pentru ARNr 16S au fost identificate in total trei haplotipuri mitocondriale la probele de pastrav curcubeu analizate. Probele O_mykiss_ Damb si O_mykiss_Gilau prezinta acelasi haplotip, in timp ce probele O_mykiss_I10 si O_mykiss_KH prezinta haplotipuri mitocondriale distincte pentru secventa genica ARNr 12S analizata. Existenta mai multor haplotipuri mitocondriale la O. mykiss, atat pentru gena ARNr 16S, cat si pentru ARNr12S, este explicabila, luand in considerare ca aceasta specie a fost incrucisata selectiv, la ora actuala fiind prezente in pastravarii un numar destul de mare de varietati de O. mykiss.

In cazul probelor de lipan analizate de noi, secventa obtinuta pentru un fragment din gena pentru ARNr 12S a fost aliniata cu o secventa similara din GenBank (FJ853655) cu ajutorul programului ClustalX. Comparativ cu secventa genei pentru ARNr 12S din baza de date NCBI, in cazul secventei de Thymallus thymallus analizate de noi au fost identificate urmatoarele polimorfisme: 314 A>G, 502G>A. Numarul de variatii nucleotidice existente intre secventa genei mitocondriale pentru ARNr 12S de la specia de lipan din Romania (raul Cerna) si secventa omoloaga din GenBank este acelasi ca in cazul genei pentru ARNr 16S. Acestea polimorfisme reprezinta mutatii silentioase, cu frecventa aleatoare si care, se pare ca nu afecteaza functia genelor, ci au rol evolutiv. Numarul relativ scazut de variatii nucleotidice, indica un grad de conservare ridicat a secventei genelor mitocondriale care codifica pentru ARNr la Thymallus thymallus.

La Salvelinus fontinalis, secventele obtinute pentru un fragment din gena mitocondriala care codifica pentru ARNr 12S au fost aliniate si comparate cu secventa similara din GenBank (NC_000860).

Aliniamentul realizat cu programul ClustalX, arata ca intre secventele nucleotidice provenid de la indivizii de pastrav fantinel din Romania, din diferite bazine hidrografice- raul Bratia (bazin Arges), raul Gilau (bazin Lotru) si din crescatorii (ferma RNP Bradisor, jud. Valcea) si secventa omoloaga din GenBank nu exista variatii, situatie intalnita si in cazul genei pentru ARNr 16S analizate anterior. Astfel, ambele gene mitocondriale care codifica pentru ARNr nu prezinta polimorfisme interspecifice si nu pot fi utilizate ca marker pentru diferentierea intre populatiile de pastrav fantinel, izolate reproductiv.

Secventele pentru ARNt^Pro/Thr obtinute la speciile de salmonide din Romania, au fost alniate cu secventele similare din GenBank si s-a observat ca aceasta regiune din genomul mitocondrial este o regiune conservata la speciile analizate. La speciile de salmonide, s-a identificat o singura diferenta fata de seventele din baza de date, constand in deletia unui rest de T.

Secventele obtinute pentru fragmentele genelor ARNr 16S, ARNr 12S si ARNt^Pro/Thr au fost utilizate pentru stabilirea relatiilor filogenetice la speciile de salmonide din Romania cu folosind programul PHYLIP 3.68. In cazul genei mitocondriale, ARNr 16S, la cele 5 specii de salmonide din Romania au fost analizate 864 de situsuri nucleotidice, avand compozitia in baze azotate prezentata in Tabelul 3.

Tabel 3: Compozitia in nucleotide a fragmentului amplificat pentru gena ARNr 16S la speciile de salmonide din Romania.

Secventele nucleotidice obtinute pentru un fragment din gena mitocondriala ARNr 16S la salmonidele din Romania au fost aliniate cu programul ClustalW . Din cele 864 de situsuri nucleotidice, 690 sunt situsuri identice. Dintre polimorfismele interspecifice inregistrate la nivelul seventei genei ARNr 16S, 75 sunt tranzitii si 97 sunt transversii, raportul Ts/Tv de 0,8 Dintre cele 864 situsuri nucleotidice analizate, urmatoarele 81 de situsuri sunt informative din punct de vedere parcimonic.