Numararea celulelor dintr-o cultura

Numararea celulelor dintr-o cultura

Determinarea numarului celulelor dintr-o suspensie celulara, raportat la volum sau suprafata recipientului de cultura, este o metoda clasica de monitorizare a conditiilor de cultivare a celulelor (stabileste profilul general al cresterii culturii), a viabilitatii si proliferarii celulelor.

Numararea se realizeaza cu ajutorul unui hemocitometru, care este o lama de sticla mai groasa pe care este prezenta o fanta in care este plasat un volum mic din suspensia celulara de evaluat. Fanta este divizata in noua sectiuni, din care numai cele patru sectiuni marginale sunt utilizate in numararea celulelor.

Fiecare patrat al hemocitometrului corespunde unui volum total de 0,1 mm³ permitand determinarea numarului total de celule din 1 ml suspensie celulara.

Figura 2. Grila hemacitometrului si celulele etalate pe ea

Etapele numararii sunt :

1. Se spala lama si lamela hemocitometrului cu etanol 70 %, existenta unor piese perfect curate fiind critica pentru determinare.
2. Se recolteaza celulele prin tripsinizarea monostratului celular.
3. Se pipeteaza circa 10 ml suspensie celulara intre lama si lamela astfel incat sa umple fanta hemocitometrului.
4. Se utilizeaza un microscop in contrast de faza cu un obiectiv 10 si se focalizeaza pe liniile grilei din fanta.
5. Se numara celulele din cele patru careuri din varfuri (fiecare cu 16 patrate), fiecare cu un volum de 0,1 mm³ si se face media.

6.     Daca numarul de celule per careu este mai mare de 100 se repeta operatiile cu o suspensie celulara diluata.

7. Numarul celulelor se multiplica cu 10⁴ pentru a exprima valorile in celule/ml suspensie.