Amplificarea genelor ARNr16S, ARNr12S si ARNt la salmonide

Amplificarea genelor ARN_r16S, ARN_r12S si ARN_t  la salmonide

Pentru analiza genelor ARNr16S, ARNr12S si ARNt si stabilirea relatiilor filogenetice existente intre speciile de salmonide din Romania se realizeaza mai intai o reactie de amplificare prin metoda PCR a ADN extras anterior.

Secventele primerilor utilizati pentru amplificarea fragmentelor genice de interes sunt prezentate in  Tabelul 5.

Tabel 5: Secventele primerilor

Dupa amplificare, pentru a putea fi vizualizate, fragmentele obtinute sunt supuse unei elecroforeze in gel de agaroza 2%.  Estimarea marimii fragmentelor amplificate se face prin migrarea concomitenta a unui marker de masa moleculara 100 pb (100 bp DNA Ladder- Promega).

Reactivi si aparatura

Probe de ADN extrase de la exemplarele ce urmeaza sa fie analizate.

Reactivi PCR:

o      amestec de deoxi-nucleotide, 10 mM din fiecare;

o               clorura de magneziu 25 mM;

o               tampon PCR 10X care contine 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8,3;

o               ADN polimeraza AmpliTaq Gold 5 U/μl;

o               apa ultrapura;

o                primeri (Tabel 4) 20 μM

Reactivi pentru electroforeza:

o               tampon de electroforeza: TAE 1X - TRIS 0,040 M, acid acetic 0,040 M, EDTA 0,002 M. Se prepara sub forma unei solutii 10X care este apoi diluata;

o      tamponul probei: albastru de bromfenol 0,3%, glicerol 30% in TAE 1X;

o      solutie de bromura de etidium 0,5 mg/ml;

o      marker de masa moleculara 100 pb (DNA Ladder 100 bp - Promega);

o      agaroza.

Tanc de electroforeza orizontala pentru acizi nucleici Mini-Sub CELL GT si sursa de curent PowerPac Basic (Bio-Rad).

Sistem de video documentare BIO-PROFIL (Vilber-Lourmat).

Plita cu incalzire si agitare magnetica MR 3001 (Heidolph).

Standard de masa moleculara "Gene-Scan-500 LIZ Size Standard". 

Formamida deionizata.

Termociclor GeneAmp PCR System 9700  (Applied Biosystems).

Analizator genetic automat ABI Prism 310 (Applied Biosystems).

Microcentrifuga MiniSpin (Eppendorf).

Agitator REAX Top (Heidolph).

Termobloc TDB 120 (Biosan).

Mod de lucru

Pentru fiecare exemplar analizat au fost reactia PCR a fost realizata in modul urmator:

se adauga reactivii din Tabelul 6 pentru a obtine amestecul de reactie;

vortexare si centrifugare;

se adauga 20 ml din amestecul de reactie in cate un tub de PCR de 0,2 ml pentru fiecare animal testat;

se adauga 5 ml din ADN diluat corespunzator (~80 ng/ml) de la fiecare exemplar;

vortexare si centrifugare;

tuburile se aseaza in aparatul de PCR.

Tabel 6: Componentele si volumele amestecului de PCR.

Tabel 7: Schema reactiei PCR pentru genele ARNr 16S si ARNr 12S.

Tabel  8: Schema reactiei PCR in gradient de temperatura pentru genele ARNt.

Pentru realizarea reactiei PCR:

se programeaza aparatul de PCR la parametrii indicati in Tabelul 7, 8.

amplificare PCR;

produsii obtinuti sunt pastrati la 2 - 6 C pana la analiza.

Produsii obtinuti sunt supusi unei electroforeze orizontale, in gel de agaroza 2%, in sistem submers (tampon TAE 1X). Vizualizarea gelului se va face in lumina UV.