Tehnica pcr-rflp

Tehnica PCR-RFLP

Principiul metodei

In cazul salmonidelor tehnica PCR-RFLP este utilizata cu succes in realizarea unei diferentieri interspecifice pe baze moleculare. Astfel, este amplificata prin tehnica PCR o regiune ampla (aproximativ 2300 pb) de la nivelul genomului mitocondrial, iar ampliconii obtinuti sunt digerati cu ajutorul unor enzime de restrictie specifice. Amprenta fragmentelor rezultate in urma digestiei difera de la o specie la alta furnizand astfel o metoda moleculara eficienta de diferentiere intre speciile de salmonide.

Tehnica PCR-RFLP se bazeaza pe compararea profilelor de restrictie rezultate in urma digestiei ADN obtinut prin amplificare cu endonucleaze de restrictie. Eventualele mutatii care apar la nivelul secventei ADN pot crea sau modifica un situs de restrictie avand drept rezultat obtinerea de fragmente de restrictie diferite.

Enzimele de restrictie au fost descoperite in urma studierii fenomenului de rezistenta bacteriana la atacul bacteriofagilor, determinat de sinteza unor enzime de restrictie cu rol in degradarea materialului genetic fagic si protejarea celui propriu.

Descoperirea, purificarea si caracterizarea unui numar foarte mare de astfel de enzime a impus adoptarea unei nomenclaturi universale. Astfel, pentru denumirea lor se foloseste un cod de trei litere, in format italic, prima litera semnificand genul, iar celelalte doua specia bacteriana de la care a fost izolata enzima. (ex: Eco - Escherichia coli). In unele cazuri, o a patra litera, in format normal, va indica tulpina bacteriana. Daca o anumita tulpina bacteriana are mai mult de un sistem de restrictie-modificare, acestea se vor identifica prin numere romane.

In ceea ce priveste materialul din care sunt confectionate bazinele, parerile sunt impartite intre specialisti. Unii autori recomanda bazinele din pamant (acolo unde solul este argilos si impermeabil), argumentand in favoarea acestor bazine urmatoarele:

in bazinele de pamant se dezvolta o bogata fauna nutritiva minuscula cu efect direct in scaderea cantitatii de furaje suplimentare artificiale si cu un efect indirect in obtinerea unei carcase cu caracteristici organoleptice (gust, miros) superioare celor obtinute in bazinele betonate;

hrana neconsumata de pesti este descompusa de bacteriile existente in sol;

costuri reduse de amenajare a unor astfel de bazine;

bazinele de ciment sunt mai putin igienice decat cele de pamant (foto.).

Foto. Bazin de pamant - Pastravaria Campul Cetatii, Jud. Mures

Exista insa si argumente in defavoarea unor astfel de bazine:

• nu sunt recomandate categoriilor mici de varsta (puiet, tineret) intrucat aceste bazine prezinta un grad ridicat de suspensii fine, care colmateaza branhiile acestor exemplare, afectand direct-respiratia si indirect-cresterea;
• transparenta apei este mult diminuata in comparatie cu bazinele betonate;
• unele mamifere acvatice (factori limitativi) pot sapa galerii pana la bazine si astfel se constata pierderi considerabile in randul materialului de cultura;
• recoltarea pestilor se desfasoara cu dificultate din cauza transparentei reduse, la fel si inventarierea materialului de cultura;
• deseori, malurile acestor bazine se surpa iar lucrarile de intretinere se desfasoara cu dificultate.

Indiferent de parerile impartite ale specialistilor in domeniu, bazinele betonate prezinta un trend ascendent, semn ca pana la urma sunt de preferat, astazi in Romania putine pastravarii utilizand bazine de pamant: Campul Cetatii, Prejmer.

Furajarea pestilor se desfasoara de cele mai multe ori manual, dar incet-incet tehnologia moderna patrunde si in acest domeniu, astazi existand sisteme de furajare cu autoservire sau automatizate complet.

Sistemele clasice intensive de crestere a pastravilor sunt cele mai raspandite la ora actuala in Romania si probabil vor mai trece ani buni pana cand alte sisteme de crestere le vor lua locul, insa in mod cert acestea prezinta unele dezavantaje ce trebuiesc remediate:

suprafete de teren relativ mari, in conditiile in care pretul terenurilor din zonele montane (si nu numai) au explodat, din cauza investitiilor masive in turismul montan;

consum mare de apa;

un personal numeros care deserveste desfasurarea proceselor tehnologice, cu efect direct asupra cresterii nivelului cheltuielilor;

expunerea la riscul de a prelua ape poluate din sursa de alimentare;

dependenta de factorii climaterici (seceta, canicula, ger, inghet) cu efect direct asupra vitezei de crestere a materialului de cultura (foto.).

Foto. Influenta factorilor climaterici asupra pastravariilor clasice -

Pastravaria Fiad, jud. Bistrita - Nasaud

Endonucleazele de restrictie sunt enzime care recunosc secvente de ADN specifice, scurte, recunoasterea fiind urmata de legare si apoi clivare, fie la nivelul situsului, fie la o distanta oarecare de acesta. Sistemele de restrictie-modificare (pot indeplini si functia de metilare) au fost impartite in trei categorii: I, II si III. Categoriile I si III constau in enzime care au atat functii de restrictie cat si functii de metilare. Ambele tipuri recunosc secvente specifice, nemetilate, de ADN dublu catenar. Enzimele din categoria I cliveaza ADN intr-o maniera situs-nespecifica, iar cele din categoria III taie la nivelul unor situsuri specifice situate la o distanta de 25-27 nucleotide de secventa de recunoastere. In categoria II sunt incluse toate enzimele cu capacitate de restrictie-modificare care actioneaza exact la nivelul situsurilor de recunoastere pe care le scindeaza sau modifica.

Experimental, se recomanda ca pentru o anumita secventa ADN sa se identifice posibilele situsuri de restrictie caracteristice genotipului normal. Ulterior se verifica daca mutatiile pe care dorim sa le identificam afecteaza vreunul dintre aceste situsuri. Acestea pot modifica un situs de restrictie deja existent sau pot genera un situs nou. In abordarea moderna, tehnica RFLP se realizeaza prin amplificarea zonei de interes prin reactie PCR si digestia cu enzime de restrictie a ampliconilor obtinuti. Ea poate fi folosita pentru genotipare individuala, identificarea de polimorfisme normale si patologice si identificarea profilelor de restrictie ale microorganismelor.