Amplificarea regiunii D-loop mitocondriale la salmonide

Amplificarea regiunii D-loop mitocondriale la salmonide

Pentru analiza regiunii D-loop mitocondriale si stabilirea relatiilor filogenetice existente intre speciile de salmonide din Romania se realizeaza mai intai o reactie de amplificare prin metoda PCR a ADN extras anterior. Dupa amplificare fragmentele obtinute sunt supuse unei elecroforeze in gel de agaroza 2%. Estimarea marimii fragmentelor amplificate se face prin migrarea concomitenta a unui marker de masa moleculara.

Reactivi si aparatura:

Probe de ADN extrase de la exemplarele ce urmeaza sa fie analizate.

Reactivi PCR:

o      amestec de deoxi-nucleotide, 10 mM din fiecare;

o      clorura de magneziu 25 mM;

o      tampon PCR 10X care contine 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8,3;

o      ADN polimeraza AmpliTaq Gold;

o      apa ultrapura;

o       primeri sens si antisens

- Reactivi pentru electroforeza:

o      tampon de electroforeza: TAE 1X - TRIS 0,040 M, acid acetic 0,040 M, EDTA 0,002 M. Se prepara sub forma unei solutii 10X care este apoi diluata;

o      tamponul probei: albastru de bromfenol 0,3%, glicerol 30% in TAE 1X;

o      solutie de bromura de etidium 0,5 mg/ml;

o      marker de masa moleculara DNA Ladder 100 bp (Promega);

o      agaroza.

- Tanc de electroforeza orizontala pentru acizi nucleici Mini-Sub CELL GT si sursa de curent PowerPac Basic (Bio-Rad).

- Sistem de video documentare BIO-PROFIL (Vilber-Lourmat).

- Plita cu incalzire si agitare magnetica MR 3001 (Heidolph).

- Formamida deionizata.

- Termociclor GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems).

- Analizator genetic automat ABI Prism 3130 (Applied Biosystems).

- Microcentrifuga MiniSpin (Eppendorf).

- Agitator REAX Top (Heidolph).

- Termobloc TDB 120 (Biosan).

Mod de lucru

Pentru fiecare exemplar analizat reactia PCR a fost realizata in modul urmator:

se adauga reactivii prezentati in Tabelul 4 pentru a obtine amestecul de reactie; vortexare si centrifugare;

se adauga 20 ml din amestecul de reactie in cate un tub de PCR;

se adauga 5 ml din ADN diluat corespunzator de la fiecare exemplar;

vortexare si centrifugare;

tuburile se aseaza in aparatul de PCR.

Pentru realizarea reactiei PCR:

se programeaza aparatul de PCR la parametrii indicati in Tabelul 5.

amplificare PCR;

produsii obtinuti sunt pastrati la 2 - 6 C pana la analiza.

Produsii obtinuti sunt supusi unei electroforeze orizontale, in gel de agaroza 2%, in sistem submers (tampon TAE 1X). Vizualizarea gelului se va face in lumina UV.

Tabel 4. Componentele si volumele amestecului de PCR.

Tabel 5. Schema reactiei PCR pentru amplificarea regiunii D-Loop la salmonide.