Optimizarea protocoalelor PCR pentru amplificarea regiunii mitocondriale D-loop

Optimizarea protocoalelor PCR pentru amplificarea regiunii mitocondriale D-loop

Initial s-a determinat temperatura de hibridizare optima pentru fiecare set de primeri prin PCR in gradient de temperatura. Ampliconii au fost verificati prin electroforeza in gel de agaroza 2%, obtinandu-se profile electroforetice din Figurile 1-4.

In final a fost optimizat protocolul de amplificare pentru regiunea mitocondriala D-loop la speciile de salmonide analizate si au fost alese temperaturile optime pentru hibridizarea primerilor.

Figura 1. Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR in gradient de temperatura pentru regiunea mitocondriala D-loop la Thymallus thymallus. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-6 Fragmente obtinute la urmatoarele temperaturi de hibridizare: 1 - 59,1sC; 2 - 58,3sC; 3 - 55,9sC; 4 - 55,1sC; 5 - 54,4sC; 6 - 53,6 sC.

Figura 2.. Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR in gradient de temperatura pentru regiunea mitocondriala D-loop la Salmo trutta fario. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-5 Fragmente obtinute la urmatoarele temperaturi de hibridizare: 1 - 60sC; 2 - 59,1sC; 3 - 58,3sC; 4 - 57,4sC; 5- 56,6sC.

In ceea ce priveste materialul din care sunt confectionate bazinele, parerile sunt impartite intre specialisti. Unii autori recomanda bazinele din pamant (acolo unde solul este argilos si impermeabil), argumentand in favoarea acestor bazine urmatoarele:

in bazinele de pamant se dezvolta o bogata fauna nutritiva minuscula cu efect direct in scaderea cantitatii de furaje suplimentare artificiale si cu un efect indirect in obtinerea unei carcase cu caracteristici organoleptice (gust, miros) superioare celor obtinute in bazinele betonate;

hrana neconsumata de pesti este descompusa de bacteriile existente in sol;

costuri reduse de amenajare a unor astfel de bazine;

bazinele de ciment sunt mai putin igienice decat cele de pamant (foto.).

Foto. Bazin de pamant - Pastravaria Campul Cetatii, Jud. Mures

Exista insa si argumente in defavoarea unor astfel de bazine:

• nu sunt recomandate categoriilor mici de varsta (puiet, tineret) intrucat aceste bazine prezinta un grad ridicat de suspensii fine, care colmateaza branhiile acestor exemplare, afectand direct-respiratia si indirect-cresterea;
• transparenta apei este mult diminuata in comparatie cu bazinele betonate;
• unele mamifere acvatice (factori limitativi) pot sapa galerii pana la bazine si astfel se constata pierderi considerabile in randul materialului de cultura;
• recoltarea pestilor se desfasoara cu dificultate din cauza transparentei reduse, la fel si inventarierea materialului de cultura;
• deseori, malurile acestor bazine se surpa iar lucrarile de intretinere se desfasoara cu dificultate.

Indiferent de parerile impartite ale specialistilor in domeniu, bazinele betonate prezinta un trend ascendent, semn ca pana la urma sunt de preferat, astazi in Romania putine pastravarii utilizand bazine de pamant: Campul Cetatii, Prejmer.

Furajarea pestilor se desfasoara de cele mai multe ori manual, dar incet-incet tehnologia moderna patrunde si in acest domeniu, astazi existand sisteme de furajare cu autoservire sau automatizate complet.

Sistemele clasice intensive de crestere a pastravilor sunt cele mai raspandite la ora actuala in Romania si probabil vor mai trece ani buni pana cand alte sisteme de crestere le vor lua locul, insa in mod cert acestea prezinta unele dezavantaje ce trebuiesc remediate:

suprafete de teren relativ mari, in conditiile in care pretul terenurilor din zonele montane (si nu numai) au explodat, din cauza investitiilor masive in turismul montan;

consum mare de apa;

un personal numeros care deserveste desfasurarea proceselor tehnologice, cu efect direct asupra cresterii nivelului cheltuielilor;

expunerea la riscul de a prelua ape poluate din sursa de alimentare;

dependenta de factorii climaterici (seceta, canicula, ger, inghet) cu efect direct asupra vitezei de crestere a materialului de cultura (foto.).

Foto. Influenta factorilor climaterici asupra pastravariilor clasice -

Pastravaria Fiad, jud. Bistrita - Nasaud

Figura 3. Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR in gradient de temperatura pentru regiunea mitocondriala D-loop la Salvelinus fontinalis. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-5 Fragmente obtinute la urmatoarele temperaturi de hibridizare: 1 - 55,9sC; 2 - 55,1sC; 3 - 54,4sC; 4 - 52,7sC; 5- 51,9sC.

Figura 4. Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR in gradient de temperatura pentru regiunea mitocondriala D-loop la Oncorhynchus mykiss. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-5 Fragmente obtinute la urmatoarele temperaturi de hibridizare: 1 - 51sC; 2 - 52,7sC; 3 - 55,1sC; 4 - 57,4sC; 5- 59,1sC.