Optimizarea protocoalelor PCR pentru genele mitocondriale ARNr 16S, ARNr 12S si ARNt

Optimizarea protocoalelor PCR pentru genele mitocondriale ARNr 16S, ARNr 12S si ARNt

Initial s-a determinat temperatura de hibridizare optima pentru fiecare set de primeri prin PCR in gradient de temperatura. Ampliconii au fost verificati prin electroforeza in gel de agaroza 2%, obtinandu-se urmatoarele profile electroforetice: pentru gena ARNr 16S - Figurile 1 - 7, pentru gena ARNr 12S - Figurile 8 - 12  si pentru gena ARNt^Pro/Thr - Figurile 13-15.

Figura 1: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR in gradient de temperatura pentru gena ARNr 16S la Oncorhynchus mykiss. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-4 Fragmente obtinute la urmatoarele temperaturi: 1-50sC; 2-50,9sC; 3-52,4sC; 4-54,6sC.

Figura 2: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR in gradient de temperatura pentru gena ARNr 16S la Oncorhynchus mykiss. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-4 Fragmente obtinute la urmatoarele temperaturi de hibridizare: 1 - 57,7sC; 2 - 59,9sC; 3 - 61,3sC; 4 - 62sC.

Figura 3: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR in gradient de temperatura pentru gena ARNr 16S la Salmo trutta fario. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-5 Fragmente obtinute la urmatoarele temperaturi de hibridizare: 1 - 60sC; 2 - 59,1sC; 3 - 57,4sC; 4 - 56,6sC; 5 - 55,9 sC.

Figura 4: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR in gradient de temperatura pentru gena ARNr 16S la Salmo trutta fario. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-5 Fragmente obtinute la urmatoarele temperaturi de hibridizare: 1 - 55,1sC; 2 - 53,6sC; 3 - 52,7sC; 4 - 51,9sC; 5 - 51sC.

Figura 5: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR in gradient de temperatura pentru gena ARNr 16S la Salvelinus fontinalis. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-5 Fragmente obtinute la urmatoarele temperaturi de hibridizare: 1 - 60sC; 2 - 59,1sC; 3 - 57,4sC; 4 - 56,6sC; 5- 55,9 sC.

Figura 6: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR in gradient de temperatura pentru gena ARNr 16S la Salvelinus fontinalis. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-5 Fragmente obtinute la urmatoarele temperaturi de hibridizare: 1 - 55,1sC; 2 - 53,6sC; 3 - 52,7sC; 4 - 51,9sC; 5 - 51sC.

Figura 7: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR in gradient de temperatura pentru gena ARNr 16S la Thymallus thymallus. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-5 Fragmente obtinute la urmatoarele temperaturi de hibridizare: 1 - 59,1sC; 2 - 58,3sC; 3 - 55,9sC; 4 - 55,1sC; 5 - 54,4sC; 6 - 53,6 sC; 7 - 51,9 sC.

Referat: Interviu cu Maestrul sportului FIDE Tiberiu Georgescu Referat: Fotbalul la 14-18 ani

Figura 8: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR in gradient de temperatura pentru gena ARNr 12S la Oncorhynchus mykiss. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-5 Fragmente obtinute la urmatoarele temperaturi de hibridizare: 1 - 62sC; 2 - 61,3sC; 3 - 59,9sC; 4 - 57,7sC; 5- 54,6sC; 6- 52,4 sC; 7- 50,9 sC.

Figura 9 Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR in gradient de temperatura pentru gena ARNr 12S la Salmo trutta fario. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-5 Fragmente obtinute la urmatoarele temperaturi de hibridizare: 1 - 60sC; 2 - 59,1sC; 3 - 58,3sC; 4 - 57,4sC; 5- 56,6sC.

Figura 10: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR in gradient de temperatura pentru gena ARNr 12S la Salmo trutta fario. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-5 Fragmente obtinute la urmatoarele temperaturi de hibridizare: 1 - 55,9sC; 2 - 55,1sC; 3 - 54,4sC; 4 - 52,7sC; 5- 51,9sC.

Figura 11:Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR in gradient de temperatura pentru gena ARNr 12S la Salvelinus fontinalis. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-5 Fragmente obtinute la urmatoarele temperaturi de hibridizare: 1 - 60sC; 2 - 59,1sC; 3 - 58,3sC; 4 - 57,4sC; 5- 56,6sC.

Figura 12: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR in gradient de temperatura pentru gena ARNr 12S la Salvelinus fontinalis. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-5 Fragmente obtinute la urmatoarele temperaturi de hibridizare: 1 - 55,9sC; 2 - 55,1sC; 3 - 54,4sC; 4 - 52,7sC; 5- 51,9sC.

Figura 13: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR in gradient de temperatura pentru gena ARNt^Pro/Thr la Oncorhynchus mykiss. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-6: Fragmente obtinute la urmatoarele temperaturi de hibridizare: 1 - 51sC; 2 - 52,7sC; 3 - 55,1sC; 4 - 57,4sC; 5- 59,1sC; 6- 60 sC.

Figura 14: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR in gradient de temperatura pentru gena ARNt^Pro/Thr la Salmo trutta fario. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-6: Fragmente obtinute la urmatoarele temperaturi de hibridizare: 1 - 51sC; 2 - 52,7sC; 3 - 55,1sC; 4 - 57,4sC; 5- 59,1sC; 6- 60 sC.

Figura 15: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR in gradient de temperatura pentru gena ARNt^Pro/Thr la Salvelinus fontinalis. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-6: Fragmente obtinute la urmatoarele temperaturi de hibridizare: 1 - 51sC; 2 - 52,7sC; 3 - 55,1sC; 4 - 57,4sC; 5- 59,1sC; 6- 60 sC.

In final a fost optimizat protocolul de amplificare pentru genele codificatoare pentru ARNr 16S, ARNr 12S, respectiv ARNt^Pro/Thr si au fost alese temperaturile optime pentru hibridizarea primerilor.

In urma reactiei de amplificare au fost obtinute fragmentele prezentate in Figurile 16 - 23, pentru cele patru specii de salmonide analizate. Fragmentele au fost vizualizate prin electroforeza in gel de agaroza 2%.

Figura 16: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR pentru gena ARNr 16S. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-4 Fragmente de 942 pb amplificate pentru gena ARNr 16S la Salmo trutta fario; 5 - Fragment de 942 pb amplificat pentru gena ARNr 16S la Salmo trutta labrax; 6- Martor negativ.

Figura 17: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR pentru gena ARNr 12S. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-4 Fragmente de 776 pb amplificate pentru gena ARNr 12S la Salmo trutta fario; 5 - Fragment de 776 pb amplificat pentru ARNr 12S la Salmo trutta labrax.

Figura 18: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR pentru gena ARNr 16S. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-6: Fragmente de 940 pb amplificate pentru gena ARNr 16S la Oncorhynchus mykiss; 7 - Martor negativ.

Figura 19: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR pentru gena ARNr 16S. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-6: Fragmente de 842 pb amplificate pentru gena ARNr 16S la Oncorhynchus mykiss.

Figura 20: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR pentru gena ARNr 16S. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-6: Fragmente de 819 pb amplificate pentru gena ARNr 16S la Salvelinus fontinalis; 7 - Martor negativ.

Figura 21: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR pentru ARNr 12S. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-6: Fragmente de 925 pb amplificate pentru ARNr 12S la Salvelinus fontinalis; 7- Martor negativ.

Figura 22: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR pentru gena ARNt^Pro/Thr. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1-2: Fragmente de 205 pb amplificate pentru gena ARNt^Pro/Thr la Oncorhynchus mykiss; 3-4: Fragmente de 222 pb pentru gena ARNt^Pro/Thr la Salvelinus fontinalis; 5-6: Fragmente de 223 pb pentru gena ARNt^Pro la Salmo trutta fario; 7- Martor negativ.

Figura 23: Electroforeza in gel de agaroza 2% pentru evidentierea produsilor reactiei PCR la Thymallus thymallus. M - Marker de masa moleculara 100 bp; 1- Fragment de 942 pb amplificat pentru gena ARNr 16S; 2 - Fragment de 842 pb amplificat pentru gena ARNr 12S; 3- Fragment de 205 pb amplificat pentru gena ARNt^Pro/Thr; 4 - Martor negativ.