Tehnica pcr-rflp

Tehnica PCR-RFLP

Material biologic: probe de ADN genomic extrase de la exemplare de salmonide provenind din specii diferite.

Reactivi si aparatura pentru reactia de amplificare: i) amestec de deoxinucleotide, 10 mM din fiecare; ii) clorura de magneziu 25 mM; iii) tampon PCR 10X care contine 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8,3; iv) ADN polimeraza 5 U/μl; v) apa ultrapura; vi) primer sens, 20 μM si primer antisens, 20 μM; vii) aparat PCR; viii) minicentrifuga; ix) agitator.

Reactivi pentru reactia de restrictie: i) tampon de restrictie: 60 mM TRIS-HCl, 1 mM NaCl, 60 mM MgCl₂, 10 mM DTT (ditiotreitol) pH 7,5; ii) albumina serica bovina (BSA) acetilata 10 μg/μl; iii) endonucleaza de restrictie Hinf I 10 U/μl; iv) minicentrifuga; v) agitator; vi) termobloc.

Reactivi si aparatura pentru electroforeza: i) tampon de electroforeza TAE 1X - TRIS 40 mM, acid acetic 40 mM, EDTA 2 mM care se prepara ca solutie 10X si este diluat inainte de folosire; ii) tamponul probei care contine albastru de bromfenol 0,3% si glicerol 30% in TAE 1X; iii) solutie de bromura de etidiu 10 mg/ml; iv) marker de masa moleculara; v) agaroza; vi) tanc de electroforeza orizontala pentru acizi nucleici; vii) sursa de curent; viii) transiluminator UV; ix) plita cu incalzire si agitare magnetica.

Mod de lucru

Amplificarea prin PCR

1. Reactivii prezentati in tabelul 6 se adauga intr-un tub de minicentrifuga pentru a obtine amestecul de reactie. Se agita si se centrifugheaza usor.

2. Se adauga 20 ml din amestecul de reactie in cate un tub de centrifuga de 200 μl pentru fiecare exemplar testat.

3. Se adauga 5 ml ADN extras de la fiecare exemplar de testat, diluat corespunzator (circa 50 ng/reactie). Se agita si se centrifugheaza usor.

4. Tuburile se aseaza in aparatul PCR si acesta este setat in conformitate cu programul prezentat in tabelul 7.

Tabel 6. Reactivi si cantitati necesare realizarii reactiei PCR.

Tabel 7. Etapele reactiei PCR.

Electroforeza in gel de agaroza in vederea vizualizarii produsilor de amplificare

Dupa terminarea reactiei PCR se realizeaza o electroforeza in gel de agaroza pentru vizualizarea produsilor de amplificare. Produsii de amplificare se amesteca cu tamponul probei si se incarca in godeuri. Se conecteaza tancul la sursa de curent si se porneste electroforeza. Migrarea se desfasoara la tensiune constanta si la temperatura camerei, timp de 40-50 de minute, in functie de marimea fragmentelor amplificate.

La finalul migrarii, vizualizarea benzilor de ADN se realizeaza cu ajutorul unui transiluminator UV.

Reactia de restrictie

1. Se adauga reactivii prezentati in Tabelul 8 intr-un tub de minicentrifuga pentru a obtine amestecul de restrictie. Se agita si se centrifugheaza.

2. Digestia se desfasoara la 37sC, timp de 3 ore.

Tabel 8. Componentele si cantitatile necesare efectuarii reactiei de restrictie.

Electroforeza in gel de agaroza in vederea vizualizarii produsilor  de restrictie

Dupa terminarea reactiei de restrictie se realizeaza o electroforeza in gel de agaroza pentru vizualizarea produsilor. Produsii de restrictie se amesteca cu tamponul probei si se incarca in godeuri. Se conecteaza tancul la sursa de curent si se porneste electroforeza. Migrarea se desfasoara la tensiune constanta si la temperatura camerei, timp de 40-60 de minute, in functie de marimea fragmentelor. La finalul migrarii, vizualizarea benzilor de ADN se realizeaza cu ajutorul unui transiluminator UV.