Biologia celulelor in cultura - inginerie tisulara

BIOLOGIA CELULELOR IN CULTURA - INGINERIE TISULARA

Micromediul celular in vitro
(asigura expresia functiei specifice in vitro

Substratul de cultura

Solid (material plastic sau sticla),

Semisolid (gel de agar sau colagen)

Lichid (pentru cultura in suspensie)

Contactul cu alte celule

de acelasi tip

de tip diferit

Constituientii fizico-chimici si fiziologici ai mediului

Tipul si concentratia constituientilor nutritivi din mediu

Tipul si concentratia constituientilor moleculari ce regleaza activitatea functionala a celulalor

Sistemul de cultura (static, dinamic)

Compozitia fazei gazoase

CO2, O2, N2,, amestec de gaze, imersia completa a celulelor in mediu lichid, interfata straturilor superficiale cu aerul

Temperatura de incubare

Adeziunea celulara

Diviziunea majoritatii celulelor in cultura depinde de interactiunea cu suportul de cultura.

Pentru a se divide, celulele ancoraj-dependente se aplatizeaza, realizand contact cu suportul de cultura cu o suprafata cat mai mare (se intind pe suprafata)

Majoritatea celulelor ancoraj-dependente formeaza monostraturi confluente

Celulele ancoraj-dependente pot deveni ancoraj-independente ca urmare a transformarilor genotipice si fenotipice

Celulele nu adera de suport direct, ci prin intermediul proteinelor sintetizate si eliberate in mediul extracelular de acestea, depuse pe suport

Molecule de adeziune

Moleculele de adeziune sunt proteine transmembranare sau proteoglicani. Pot fi clasificate in trei categorii:

Proteine pentru adeziunea de tip celula-celula:

CAM-proteine Ca-independente

Cadherine Ca-dependente

Proteine pentru adeziunea de tip celula-MEC

Integrine (ligand ce contine arginina-glicina-asparagina - RGD)

Proteoglicani (structuri transmembranare care nu interactioneaza cu RGD; pot avea rol si de receptori sau molecule asociate cu receptorii pentru factorii de crestere tisulara)

Matricea extracelulara (MEC)

MEC umple saptiile intercelulare din tesuturi

Componentele MEC sunt produse in celula, apoi sunt secretate si depuse pe suprafata acesteia

Compozitia MEC depinde de tipul celulelor din tesut

(Ex. fibroblastele produc colagen tip I, condrocitele - colagen tip II, celulele epiteliale - laminina etc)

Celulele aderate de MEC controleaza compozitia MEC si invers - compozitia matricii influenteaza fenotipul celular

Referat: Determinarea grasimii din smantana prin metoda acidobutirometrica Referat: Painea - ce paine si in ce cantitate ingrasa?

Elementele structurale ale MEC

Proteine structurale - colagen

Proteine de adeziune - fibronectina, laminina

Proteiglicani (GAG+proteine) -  componenta polizaharidica cu un continut crescut de apa (hidrogel)

Interactiunea Adeziune - Citoschelet

Citoscheletul este o retea tridimensionala de proteine fibrilare cu numeroase functii (motilitate, diviziune, forma celulara si altele)

Elementele citoscheletului:

Microfilamente de actina

Filamente intermediare

Microtubuli

Moleculele de adeziune sunt legate direct sau prin intermediul altor molecule cu elementele citoscheletului

Interactiunea dintre moleculele de adeziune si citoschelet este implicata, printre altele, in fenomenele de motilitate celulara si diviziune

Motilitatea celulara in cultura

Celulele din cultura pot migra pe suprafata substratului. Migrarea are caracter diferit, in functie de tipul de celula

Cele mai mobile celule - fibroblastele in cultura (cu densitate celulara mica)

Se stabileste o polaritate de migrare (intr-o anumita directie) prin extinderea de lamelipode)

La intalnirea unei alte celule, polaritatea se inverseaza

La atingerea unui monostrat confluent se produce inhibitia de contact (incetarea migrarii si a diviziunilor celulare)

Mioblastele si celulele endoteliale au aceleasi caracteristici de motilitate in vvitro, iar la atingerea monostratului confluent se diferentiaza

Majoritatea celulelor epiteliale sunt mai putin mobile, in special la densitate celulara mare

La o densitate mica, celula epiteliala va migra pana va intalni o alta celula (nu isi va schimba polaritatea ci se va opri)

Se pot aduna in conglomerate, care, uneori, se pot deplasa pe suport organizat

CICLUL CELULAR si MECANISMELE DE REGLARE A CICLULUI CELULAR

Controlul proliferarii

Intrarea celulelor in ciclul celular este reglata de semnalele parvenite din micromediul celular

In cultura cu densitate celulara mica, marginile celulare sunt libere, determinand intinderea celulei pe substrat. Doar in starea sa intinsa la la maxim, celulele intra in diviziune ca urmare a actiunii factorilor de crestere

Densitatea mare apropie marginile celulare, schimba fenotipul, reduce gradul de intindere si opreste diviziunea

Stimulatorii sau inhibitorii intacelulari ai proliferarii sunt moleculele citoplasmatice care se formeaza in urma fosforilarii domeniilor intracelulare ale receptorilor pentru factorii de crestere si produsii de activitate ale unor gene, inclusiv oncogene.

Diferentierea in vitro

Conditiile necesare pentru diferentierea in vitro:

- densitate celulara mare

- interactiuni celula-celula si celula-MEC bine exprimate

- prezenta factorilor de diferentiere

Daca in cultura se urmareste diferentierea, este necesara definirea a doua tipuri de conditii - la inceput pentru proliferare si apoi pentru diferentiere

Caracteristicile de diferentiere se mentin in cultura pentru mai mult timp daca este creat sitemul de cultura 3D - geluri de colagen, celuloza, gelatina

Mediile pentru diferentiere sunt medii selective, fara ser fetal

Dediferentiere

Dediferentierea este un fenomen specific culturilor celulare

Cauze:

Selectia gresita a liniei progenitoare

Diviziunea excesiva a celulelor nediferentiete ale aceleeasi linii progenitoare

Absenta unor factori reglatori sau aplicarea incorecta a acestora

Absenta conexiunilor specifice de tip celula-MEC

Dediferentierea / Deadaptarea

Dediferentierea - pierderea unor functii specifice ca urmare a conversiei celulelor la un fenotip mai primitiv

De adaptarea - sistarea unor functii in lipsa unor stimuli corespunzatori (hormoni, interactiuni celula-celula, celula-MEC). Functiile sunt reexprimate dupa aplicarea conditiilor de micromediu corespunzatoare

Semnalizarea celulara

Proliferarea, diferentierea si apoptoza in vivo sunt supuse reglajului micromediului tisular (factori crestere, interactiunea celule-celule, celule-MEC), dar si a celui sistemic

Reglajul prin intermediul moleculelor solubile poate avea loc pe cale:

Endocrina - la distanta, prin intermediul sangelui

Paracrin - din aproape in aproape

homocrin  (intre celule de acelasi tip)

Heterocrin(intre celule de tip diferit)

Autocrin - celula secretoare este aceeasi cu celula tinta

Cai de semnalizare intercelulara
in vivo

Semnalizarea intercelulara
in vitro

Intr-un monostrat celular in vitro se poate discuta doar de actiuni homocrine si autocrine

Evolutia culturilor initiate la densitate mica de multe ori esueaza, ca urmare a dilutiei unor factorilori cu actiune paracrina,

Una din solutii - cultura conditionata (pe strat de celule doica - feeder layer)

Evolutia celulelor in cultura

Cultura primara este prima etapa de evolutie a celulelor in conditii in vitro, care are loc dupa migrarea celulelor din explant sau dupa dezagregarea enzimatica a tesutului

Dupa cultura primara urmeaza procedeele de subcultivare si selectie a celulelor care duc la obtinerea de liniil celulare

Evolutia celulelor in cultura primara

Evolutia celulelor in cultura de lunga durata

Rolul subculturilor

Permit diviziunea continua a celulelor sensibile la inhibitia de contact

Permit mentinerea densitatii reduse, cu mentinerea fenotipului normal in culturile cu un risc de transformare spontana crescut, la o densitate mare a celulelor (ex. fibroblastele de soarece)

Subcultura trebuie realizata la aproximativ 2/3 din panta fazei Log (inainte de a obtine monostratului confluent