Determinarea temperaturii optime de hibridizare pentru fiecare set de primeri prin PCR in gradient de temperatura

Determinarea temperaturii optime de hibridizare pentru fiecare set de primeri prin PCR in gradient de temperatura

Pentru optimizarea reactiilor de amplificare am realizat, pentru fiecare dintre regiunile D-loop la speciile analizate, reactii de PCR in gradient de temperatura. In cazul acestui tip de reactie, ADN matrita este supus concomitent unor temperaturi diferite de hibridizare a primerilor in scopul stabilirii temperaturii optime care sa permita eliminarea amplificarilor parazite si realizarea cu un randament maxim a reactiei PCR. Totodata, in decursul unei astfel de reactii de optimizare, pot fi variate si intervalele de timp in care sunt parcurse treptele de temperatura, cat si numarul de cicluri de amplificare.

Reactivi si aparatura:

Probe de ADN extrase de la exemplarele ce urmeaza sa fie analizate.

Reactivi PCR:

amestec de deoxi-nucleotide 10 mM din fiecare;

clorura de magneziu 25 mM;

tampon PCR 10X care contine 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8,3;

polimeraza AmpliTaq Gold 5 U/μl;

primeri sens si antisens.

- Reactivi pentru electroforeza:

tampon de electroforeza: TAE 1X - TRIS 0,040 M, Acid acetic 0,040 M, EDTA 0,002 M. Se prepara sub forma unei solutii 10X care este apoi diluata;

tamponul probei: albastru de bromfenol 0,3%, glicerol 30% in TAE 1X;

solutie de bromura de etidium 10 mg/ml;

marker de masa moleculara 100 bp (Promega);

agaroza.

Tanc de electroforeza orizontala pentru acizi nucleici Mini-Sub CELL GT.

- Sursa de curent PowerPac Basic (Bio-Rad).

Sistem de video documentare BIO-PROFIL (Vilber-Lourmat).

Termociclor iCycler (BioRad).

Termociclor GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems).

Microcentrifuga MiniSpin (Eppendorf).

Mod de lucru:

S-a realizat determinarea temperaturii de hibridizare specifice fiecarei perechi de primeri desemnate pentru amplificarea regiunii mitocondriale D-loop si pentru amplificarea unei regiuni mitocondriale extinse prin PCR in gradient de temperatura.

- se amesteca componentele de reactie (Tabel 1); vortexare si centrifugare;

- se adauga 20 ml din amestecul de reactie in cate un tub de PCR de 0,2 μl pentru fiecare proba analizata;

- se adauga 5 ml ADN, diluat corespunzator; vortexare si centrifugare;

- tuburile se aseaza in aparatul de PCR.

Tabel 1. Componentele amestecului PCR.

Pentru realizarea reactiei PCR in gradient de temperatura s-a programat aparatul de PCR respectand parametri prezentati in Tabelele 2 si 3.

La terminarea reactiei PCR se efectueaza o electroforeza in gel de agaroza in vederea vizualizarii produsilor de amplificare.

Initial se prepara gelul de agaroza astfel:

se izoleaza tavita aparatului de electroforeza cu banda adeziva;

se prepara un volum de 40 ml de agaroza 2% in tampon TAE 1X;

- dupa dizolvarea completa a agarozei la cald se adauga 2,3 μl bromura de etidium;

- se monteaza pieptenul si apoi se toarna gelul in tavita de electroforeza;

- se lasa aproximativ 40 de minute la temperatura camerei pentru a se solidifica, iar gelul se introduce in tancul de electroforeza.

Produsii de amplificare se amesteca cu tamponul probei si se incarca in godeuri cu o pipeta automata. Se conecteaza tancul de electroforeza la sursa de curent si se porneste electroforeza. Migrarea se desfasoara la 80V constant si la temperatura camerei, timp de 40 de minute. La finalul migrarii, vizualizarea benzilor de ADN se realizeaza pe un transiluminator UV. In functie de profilul electroforetic obtinut s-a ales temperatura de hibridizare optima pentru a permite analiza genelor luate in studiu.

Tabel 2. Schema reactiei PCR in gradient de temperatura pentru amplificarea regiunii D-loop mitocondriale la mai multe specii de salmonide.

Tabel 3. Schema reactiei PCR in gradient de temperatura pentru amplificarea unei regiuni mitocondriale extinse la mai multe specii de salmonide.