Clonarea si selectia - inginerie tisulara

CLONAREA SI SELECTIA - INGINERIE TISULARA

Aplicatii

Obtinerea unor culturi celulare omogene

Propagarea in vitro a unui anumit fenotip sau genotip celular

Eliminarea contaminarii celulelor diferentiate cu  celule nespecializate

Utilizarea ca test de supravietuire celulara la optimizarea conditiilor de cultura

Test de chimiosensibilitate si radiosensibilitate

METODE DE CLONARE CELULARA

In monostrat (in flacoane de cultura, vase Petri sau placi multicelulare)

In suspensie, prin imobilizarea celulelor in geluri sau solutii vascoase (ex. Methocel)

Particularitati de clonare

Eficienta de clonare a diferitor tipuri de celule difera

Eficienta de clonare cea mai mare este caracteristica pentru liniile celulare transformate

Eficienta de clonare a liniilor cu durata de viata limitata este mai mica. Pentru obtinerea unor clone din astfel de linii celulare este nevoie de timp si multe generatii celulare. Riscuri - senescenta celulara  

Eficienta de clonare in culturile primare este foarte mica, de cele mai multe ori = 0

Clonarea celulelor in monostrat

Clonarea prin dilutie - principala metoda de clonare celulara

Poate fi realizata in recipiente de cultura cu suprafata mai mare (Petri, flacoane)

Poate fi realizata in placi de microtitrare (placi multicelulare)

Tehnica de clonare prin dilutie celulara pe suprafete de cultura mari

Eficienta de clonare in functie de densitatea celulara

Eficienta de clonare estimata Referat: Determinarea grasimii din smantana prin metoda acidobutirometrica Referat: Painea - ce paine si in ce cantitate ingrasa?	Per ml	Per cm2	Petri de 6 cm	Petri de 9 cm
	1x104	2x103
	1x103

Tehnica de clonare prin dilutie celulara in microplaci de titrare

Cresterea eficientei de clonare

Optimizarea conditiilor de cultura

Medii potrivite (bogate in substante organice si energetice)

Adaugarea de hormoni (insulina, dexametazina)

Adaugarea de metaboliti intermediari (keto-acizi)

Ajustarea concentratiei de CO2

Tratarea substratului (polilizina, fibronectina)

Tripsinizarea (la 4oC, cu enzima de inalta puritate)

Folosirea stratului de celule feeder (doica)

Clonarea pe strat feeder (doica)

Clonarea in suspensie

Metoda aplicata pentru celulele hematopoietice si fibroblaste transformate

Cresterea in mediu agarizat (semisolid) permite mentinerea celulelor coloniei impreuna si impiedica trans-contaminarea cu celule din colonii diferite

IZOLAREA COLONIILOR

In placutile de microtitrare, izolarea coloniilor se face prin simpla tripsinizare a camerelor individuale

Separarea coloniilor de pe suprafete de cultura mai mari se face de cele mai multe ori cu ajutorul inelelor de ceramica sau inox 

Inele de clonare

Izolarea clonelor cu ajutorul inelelor de clonare

Izolarea clonelor in suspensie

Alte metode de selectie celulara

Selectia prin adeziune la substrat

Subcultura din 30 in 30 min a celulelor pornind de la o cultura primara va duce la adeziunea selectiva  mai intai a macrofagelor, apoi a fibroblastelor si la sfarsit a celulelor epiteliale

Selectia folosind substrat de adeziune diferit (componente MEC sau sarcina electrica)

Colagenul si fibronectina favorizeaza adeziunea celulelor epiteliale

Selectia prin desprindere selectiva de pe substrat

Se bazeaza pe proprietatea diferita de desprindere a celulelor de pe substrat ca urmare a tripsinizarii sau colagenizarii  (fibroblastele sunt mai usor desprinse de tripsina, in timp ce EDTA desprinde mai usor celulele epiteliale. Dispaza II desprinde celulele epiteliale de pe stratul feeder, care ramane aderat de substrat)