Cultura primara - inginerie tisulara

CULTURA PRIMARA - INGINERIE TISULARA

Generalitati

Definitie:

Cultura celulara initiata cu celule  migrate din fragmente celulare, dispersate din tesuturi dezagregate prin fragmentare sau digestie celulara, pana la momentul subcultivarii lor

Evenimentele principale:

Recoltarea tesutului

Fragmentarea/dezagregarea tesutului

Repartizarea celulelor in vase de cultura

Enzimele de dezagregare tisulara

Tripsina                         

Colagenaza

Elastaza                                

Pronaza               

Dispaza

DNAza

Hialuronidaza

Individual sau in diferite combinatii:

Ex1. Tripsina+pronaza (+DNAza):

Combinatie eficienta dar care  poate afecta celulele

Ex2. Colagenaza+dispaza (+DNAza):

Mai putin afecteaza viabilitatea celulara dar nu realizeaza o dezagregare completa a tesutului

Ex3. Colagenaza+hialuronidaza (+DNAza)

- DNAza inlatura ADNul eliberat din celulele lezate, care intefera proteoliza si incurajeaza reagregarea celulara

Conditii si recomandari

Inlaturarea grasimii si a fragmentelor de tesut necrozat

Folosirea unui instrumentar cat mai ascutit pentru minimizarea lezarii

Enzimele utilizate la dezagregare trebuie inlaturate eficient, prin mai multe centrifugari

Cultura primara se initiaza cu un numar de celule mult mai mare in comparatie cu subcultura (o parte mica de celule vor adera pe supostul de cultura)

Sunt folosite medii de cultura mai bogate in constituenti organici (Ham F12) si ser fetal de vitel

Referat: Determinarea grasimii din smantana prin metoda acidobutirometrica Referat: Painea - ce paine si in ce cantitate ingrasa?

Pentru celule specializate sunt recomandate medii selective

Tesuturile embrionare se dezagrega mai usor decat tesuturile adulte , iar viabilitatea celulara este mai mare

Tesuturile recoltate pot fi pastrate in mediu de cultura special (de transport)  

Izolarea tesuturilor embrionare animale

Tesut embrionar de soarece

Cultura fibroblatica nediferentiata, folosita frecvent pentru obtinerea straturilor doica (feeder) si studii de proliferare (inclusv citotoxicitate)

Recoltarea se face in ziua 12-13 de gestatie  (>50% din perioada gestationala- 19-21 zile) pentru a avea embrioni destul de mari, dar cu un raport bun de celule nediferentiate

Tesut embrionar de pui

Embrionii sunt mai mari (se recolteaza la 10 zile de incubare a oualor de pui)

Celulele embrionare sunt folosite pentru studii de proliferare, straturi doica si suport pentru propagarile virale

Embrionii recoltati in perioade de gestatie mai mari sunt utilizati pentru obtinerea de celule specializate (hepatocite, cardiomiocite sau celule epiteliale pulmonare

Recoltarea tesuturilor embrionare de soarece

Recoltarea tesuturilor embrionare de pui

Cultura primara prin explant

Cultura prin explant este indicata pentru fragmente tisulare mici, ale caror celule se pot pierde in urma tratamentelor enzimatice

Dezagregare enzimatica la cald

Durata intregului proces 3-4 ore

Pentru evitarea reagregarii celulare, la suspensiile celulare inainte de centrifugare poate fi adaugata DNaza

Tehnica este folosita pentru digestia relativ rapida a unor fragmente tisulare mari (embrioni  intregi de soarece sau pui)

Nu este o tehnica potrivita pentru tesuturile adulte. Digestia prelungita pentru dezagregarea tesutului fibros poate afecta celulele epiteliale

Metoda de tripsinizare la rece

Durata intregului proces - aprox. 6-18 ore

Consta in mentinerea fragmentelor celulare in solutie de tripsina pentru 6-18 ore la temperatura de +4oC (la gheata), urmata de expunerea amestecului la 37oC pentru 20-30 min.

La rece are loc doar difuzia enzimei in intreaga structura a tesutului, iar digestia  propriu-zisa la cald a tesutului are loc in doar 20-40 min

Avantaj

minimizeaza leziunilor celulare si munca laborioasa

Supravietuirea diferitor tipuri de celule

Metoda potrivita pentru fragmente de tesuturi nu foarte mari (organe embrionare)

Dispersia enzimatica utilizand colagenaza

Colagenaza este utilizata pentru dispersia tesuturilor prea froase sau prea sensibile la tripsina

Este o metoda frecvent utilizata pentru dezagregarea tumorilor (in general al epiteliilor)

Dezagregare mecanica

Utilizare

Pentru tesuturi moi:

- splina,

ficat embrionar,

tesut cerebral,

tumori moi